VEA: OZONOTERAPIA
FUNDAMENTOS E INVESTIGACIONES
EQUIPOS Y DERIVADOS

Azione DEL’oLIO OZONIZZATO (BIOPEROXOILâ ) NELLE LESIONi CHIRURGICHE DeI MODelLI PRE-CLINICI

1C.C. CARDOSO, 2S.B. MACÊDO 2J.C.T. CARVALHO, 1R. DALL’AGLIO, 4L.R. FERREIRA, 3M. GOMEZ, 1F. FRASCHINI, 1G.DE MARTINI.

1Dip. Farmacologia, Univ. Milano, Italia.
2
Lab. de Fitofármacos, Instituto de Farmácia e Nutrição, Unifenas, Brasile.
3
Ozonoil S.L., Barcelona.
4
Dip. Science Morfologiche, PUCP Caldas, Brasile.

ABSTRACT

L’olio ozonizzato é ricco d’idroperossidi ed ozonidi in grado di fornire bioperossidi lentamente ai tessuti. In questo studio e stata valutata per sette giorni l’attività del’olio ozonizzato associato con acido a-lipoico (Bioperoxoil®)in ratti Wistar, in ferite chirurgiche sperimentali. La dinamica della cicatrizzazione é stata determinata tramite studi istopatologici. L’indagine microscopica delle ferite indotte nella schiena dei topi ha dimostrato che il numero medio di fibroblasti e di vasi é significativamente piú alto (ANOVA, Student -Newman-Keuls test, p<0.0002) nelle ferite degli animali trattati con l’olio ozonizzato (Bioperoxoilâ ,70 è 35 mg/giorno) rispetto ai gruppi di controllo (olio di arachide e di girasole). Gli animali trattati solo tre volte in giorni alterni dimostrano che l’effetto é ancora più evidente nei trattati con Bioperoxoilâ , rispetto al controllo ed all’olio di girasole. I risultati elaborati tramite analisi statistica con il test di t Student (p<0.05), hanno evidenziato una differenza significativa al settimo giorno di trattamento per quanto riguarda il numero di fibroblasti e vasi neoformati, ma non per quanto riguarda il numero medio di macrofagi e neutrófili.

KEY WORDS: ozonized oil, bioperoxoil, surgical lesions, cicatrization.

 

INTRODUZIONE

La contaminazione delle ferite chirurgiche, oltre a creare disagi notevoli al paziente, comporta il prolungamento della degenza ospedaliera e, di conseguenza, aumento dei costi per l’assistenza sanitaria (ZAMORA, 1984). Il lavaggio delle ferite con soluzione di antibiotici o antisettici e l’applicazione di antibatterici ad uso topico possono diminuire il rischio di infezioni postoperatorie. L’uso topico di antibiotici è stato associato a risultati positivi (MOYLAN, 1980), ma può presentare problemi, a volte gravi, quali reazioni di ipersensibilità, resistenza batterica (DUNN, 1940; TAVARES, 1996) e, nei casi di infezioni profonde, alterazione di protezione.

Gli antibiotici ad uso topico, lo zolfo, gli antisettici ed il trattamento termico sono stati a lungo utilizzati nel trattamento delle ferite infette. Alla luce delle attuali conoscenze, é opinione largamente condivisa che, per limitare o almeno controllare la resistenza batterica e quindi diminuire i tempi di degenza ospedaliera ed i relativi costi; sia opportuno limitare l’uso di creme contenenti agenti antibatterici convenzionali (AMBER et al., 1983).

Gli antibiotici utilizzati per via topica non devono essere assorbiti a livello sistemico in quanto possono provocare gravi effetti collaterali (BOGAAR & DIPBACT, 1975). In alcune lesioni traumatiche la somministrazione topica di antibatterici è risultata più efficace di quella sistemica (CLARK, 1980). Inoltre è stato evidenziato che la profilassi con agenti antimicrobici ad uso topico permette il controllo della colonizzazione e di conseguenza consente di contrastare l’instaurarsi d’infezioni e eventualmente di diminuirne la durata, caratterizzata da una perdita di fluidi e calore (HOWARD & SIMMONS, 1994).

Anche gli antisettici di più comune utilizzo presentano dei problemi. Sono, in genere, farmaci attivi nei confronti dei microrganismi, e di solito, non producono reazioni di ipersensibilità ma possono indurre il sviluppo di resistenza batterica e provocare danni ai tessuti. Rappresentano comunque un'alternativa alla terapia topica convenzionale (AMBER e SWAIN , 1984, AMBER et al. 1983).

L'ozono è una forma allotropica dell'ossigeno caratterizzata da molecola triatomica. È termodinamicamente instabile e tende a dare origine a ossigeno molecolare e ossigeno atomico. È quindi un energico ossidante (Eo= +2,07 V) e viene spesso usato come germicida per purificare l'acqua (GURLEY, 1985). Può essere prodotto industrialmente attraverso apparecchi chiamati ozonizzatori (BLOCK, 1991).

In campo medico l'ozono viene utilizzato in miscela gassosa con ossigeno molecolare (biatomico) a concentrazione da 0 a 40 mg/ml (BOCCI et al., 1994, HELD, 1983) e le sue indicazioni vanno dalla angiogenesi, (CARDOSO et al, 2000) al trattamento di diversi patologie (FRANZINI et al, 1996; VERAZZO et al, 1995; OGATA & NAGAHATA, 1999, BOCCI, 2000) alla disinfezione delle ferite (CARDOSO et al, 2000). A causa della sua ridotta stabilità, l'ozono gassoso deve essere utilizzato prontamente (GURLEY, 1985) ed in modo adeguato in quanto presenta rischi di tossicità respiratoria (BOCCI, 2000). Il limite per la concentrazione di ozono nell'aria è di 0,2 mg/m3.

Può essere incorporato ai liquidi come il sangue, acqua o veicoli oleosi (SANSEVERINO, 1989). Le soluzioni acquose di ozono sono estremamente instabile mentre suoi prodotti di reazione con veicolo oleoso, ricco di acidi grassi insaturi, risultano ricche di ozonidi ed idroperossidi e sono in grado di conservare il potere terapeutico dell'ozono per lungo tempo (KÄMPER, 1989). Alcuni autori hanno osservato un effetto cicatrizzante ed antimicrobico dell'olio ozonizzato (MENENDEZ, 1988, RODRIGUEZ et al, 1994, LEZCANO, 2000, SIQUEIRA JR et al, 2000).

Inoltre, è stato evidenziato che una miscela di alcune sostanze biologicamente attive e oli ozonizzati in modo speziale, in particolari la miscela nominata Bioperoxoil®, formata da acido a lipoico e olio ozonizzato, producono un effetto sinergico degli effetti biologici stimolanti e riparativi (GOMEZ et al, 1999).

MATERIALI E METODI

Animali: sono stati utilizzati ratti Wistar (maschi) tra 220 e 250 gr di peso. Gli animali sono stati divisi in gruppi e sono stati mantenuti in contenitori di polietilene, a temperatura ambiente, con cibo ed acqua ad libitum, per 24 ore prima dell'esperimento.

Induzione delle ferite: dopo tricotomia, sotto anestesia generale con etere etilico, ferite circolari di 6 mm di diametro sono state prodotte nella schiena dei topi tramite punching. Subito dopo l'intervento chirurgico gli animali sono stati trasferiti in gabbie metaboliche.

Bioperoxoil: e stato utilizzato in forma liquida, sciolto in Olio di Girasole, con le seguenti concentrazioni: Ozonized Sunflower Seed Oil, 30 %, a Lipoic Acid, 0,5 %. La soluzione resultante si presenta come liquido oleoso, leggermente giallo e opalescente, di viscosità media e con odore particolare caratteristico del prodotto. Il Ozonized Sunflower Seed Oil utilizzato nella miscela e stato ottenutto secondo tecnologia catalitica, fino a Indice di Perossidi di circa 700.

Esperimenti :

1°: Divisi in due gruppi da 28 ratti ciascuno, gli animali sono stati trattati una volta al giorno con olio di arachide o Bioperoxoil (70 mg) per sette giorni. Sono stati sacrificati quattro animali per gruppo al giorno.

2°: Divisi in tre gruppi di 30 ratti ciascuno, gli animali sono stati trattati una volta al giorno con 35 mg di olio di arachide, olio di girasole o Bioperoxoil nei giorni 0, 2, e 4, dopo induzione della ferita. Sono stati sacrificati dieci animali per gruppo nei giorni 1, 3 ,e 7, dopo induzione della ferita.

Il tessuto prelevato é rimasto in soluzione di formolo al 10% fino al momento della colorazione con Ematossilina-eosina per l'esame istologico.

Test statistico: i risultati istologici sono stati valutati statisticamente. I test utilizzatati sono stati l'analisi della varianza ANOVA, seguito dal test Student-Newman-Keuls di comparazione multipla e il test "t" di Student. Sono stati considerati significativi dati con p<0.05.

 

RISULTATI E DISCUSSIONE

Nel processo di cicatrizzazione, i primi giorni di riparazione del tessuto sono caratterizzati da una fase iniziale infiammatoria ed in seguito una fase di fibroplasia. In questa fase sono importanti anche i cambiamenti nella vascolarizzazione (neovascolarizzazione) che saranno responsabili della rimozione della necrosi locale e della irrorazione del nuovo tessuto in crescita (COTRAN et al, 1991).

La necrosi di materiale organico produce sostanze azotate come proteine e ammine, acido solfidrico e acidi grassi a catena corta, ed altre sostanze. Questi prodotti sono tossici e possono disturbare il processo di cicatrizzazione. L'ossidazione locale può intervenire nella degradazione di queste tossine.

Nei tessuti lisati o ipossici i macrofagi non vengono stimolati a riorganizzare le ferite ed i fibroblasti non producono nuovo collageno, e cosi può avvenire la perpetuazione della lesione (BROWN, et al, 1998). Bioperoxoil, per la sua capacità di fornire bioperossidi arricchiti di ossigeno ed acido a-lipoico, entrambi stimolanti dei sistemi enzimatici NAD e FAD sembra esercitare effetto stimolante su questi processi una volta, come evidenziato dai risultati ottenuti al settimo giorno, in cui è stato osservato un aumento significativo (test "t" di Student, p<0,05) del numero medio di neovasi e di fibroblasti (Figure 1 e 2).

Fig 1


Figura 1 - Numero medio di vasi in ferite indotte in ratti trattati con olio ozonizzato (Bioperoxoil â - n=28) 70 mg al giorno ed su animali trattati con olio di arachide (gruppo di controllo - n=28), una volta al giorno per sette giorni. Ogni punto rappresenta la media ± EPM del numero di vasi di ogni gruppo.

Fig 2


Figura 2 - Numero medio di fibroblasti in ferite indotte in ratti trattati con olio ozonizzato (Bioperoxoil â - n=28) 70 mg al giorno ed in ratti trattati con olio di arachide (gruppo di controllo - n=28), una volta al giorno per sette giorni. Ogni punto rappresenta la media ± EPM del numero di fibroblasti di ogni gruppo.

L'apparente variabilità osservata a giorni alterni in forma di onda circadiana, potrebbe condurre a considerare la possibilità che il trattamento giornaliero con 70 mg sia eccessivo. Questo potrebbe rendere difficile la normale "respirazione di fase 3, aerobica," del tessuto, in quanto la presenza di una pellicola oleosa permanente potrebbe costituire una barriera impermeabile che ostacola il normale scambio gassoso. Un'altra ipotesi può essere correlata alle ben note correlazioni che legano la neoangiogenesi all'attività delle COX2 e la fibroblastogenesi a quella del TGF2. Una troppo elevata disponibilità di perossidi potrebbe inibire entrambe le citochine.

E' interessante notare come i cortisonici esplichino una attività del tutto opposta attraverso una inibizione delle COX1-2 e delle lipoossigenasi (CANNAVESE, 1992) e, conseguentemente, delle prostaglandine, dei leucotrieni e delle citochine infiammatorie.

Il blocco di queste ultime, specialmente della INTERLEUKINA 6, sembra responsabile del mancato infiltrato linfocitario, legato a questo fattore di crescita. Questo fenomeno è stato notato anche nelle ferite trattate con Bioperoxoil, nonostante la molto più elevata velocità riparativa, quasi a dimostrare un effetto "liberatorio" sui fattori di crescita tissutali; il diametro delle ferite infatti è risultato mediamente dimezzato rispetto ai controlli.

Per questi motivi, è stata effettuata una serie di esperimenti in cui il trattamento è stato attuato a giorni alterni e con dosi dimezzate (35 mg.). E' stato inoltre utilizzato l'olio di girasole come secondo controllo, in quanto più affine al veicolo di Bioperoxoil per il maggiore contenuto di acido linolenico. I campioni di tessuto sono stati prelevati 3 volte nel corso dell' esperimento, in modo da effettuare 10 prelievi per punto sperimentale.

I risultati ottenuti sono riportati nelle Figure 3 e 4:

 

Fig 3


Figura 3 - Numero medio di neovasi in ferite trattate una volta al giorno con 35 mg d'olio ozonizzato (Bioperoxoil â - n=30), 35 mg d'olio di arachide (gruppo controllo - n=30), 35 mg d'olio di girasole (gruppo controllo - n=30), nei giorni 0, 2 e 4 dopo induzione della ferita. Ogni punto rappresenta la media ± EPM del numero di vasi degli animali sacrificati al 1, 3 e 7 gg. dopo induzione della ferita.

 

Fig 4


Figura 4 - Numero medio di fibroblasti in ferite trattate una volta al giorno con 35 mg d'olio ozonizzato (Bioperoxoil â - n=30), 35 mg d'olio di arachide (gruppo controllo - n=30), 35 mg d'olio di girasole (gruppo controllo - n=30), in tutti casi una volta nei giorni 0, 2 e 4 dopo induzione della ferita. Ogni punto rappresenta la media ± EPM del numero di vasi degli animali sacrificati al 1, 3 e 7 gg. dopo induzione della ferita.

Nelle Figure 5, 6 e 7 sono riportate le immagini dei campioni di tessuto prelevati al 7° giorno.

Figura 5, Control

Figura 6, Control+

Figura 7, Bioperoxoil

 

Come si può osservare, gli effetti stimolanti del Bioperoxoil® nei processi di cicatrizzazione risultano evidenti, soprattutto per quanto riguarda la neoangiogenesi.

 

CONCLUSIONI

 

Si è dimostrato l'effetto stimolante del Bioperoxoil® nei processi di neoangiogenesi e di crescita di fibroblasti nelle ferite chirurgiche sperimentali in ratti Wistar, nelle condizioni sperimentali descritte.

L'effetto stimolante del prodotto e più evidente nel caso di applicazione di quantità moderata in giorni alterni.

VEA: OZONOTERAPIA
FUNDAMENTOS E INVESTIGACIONES
EQUIPOS Y DERIVADOS

REFERENZE BIBLIOGRAFICHE

AMBER, E. I. SWAIN, S. F. Na uptudate on common wound antiseptics. Aust. Vet. Practit, 14 (1), march, 1984.)

AMBER, E. I. et al.. A comparison of. antimicrobial efficacy and tissue reaction of. four antiseptics on canine wounds. Veterinary surg., 12(2): 63-68, 1983.

BARROMEI , A. & MAITAN, S. I radicali liberi dell’ossigeno. Ed. Masson. Milão, 159p. 1995.

BOCCI, V. et al.. Ozonoterapia: ieri, oggi e domani ? Ossigeno Ozono/ Fitness & News, anno VI n.1, p.1-2, 1994.

BOGAARD A. E. J. and DIPBACT, M., Profilaxia antimicrobiana em cirurgia veterinaria. Revista Portuguesa de Ciencias Veterinária, (LXXXIII): 378- 389.

BUCKLEY, R.D., HACKNEY, J.D., CLARK, K., POSIN, C.: Ozone and human blood. Arch. Envir. Health , 30: 40, 1975.

CARDOSO et al. Sindrome de Fournier. Relato de un caso tratado com ozonoterapia topica. Proceedings of 3rd International Symposium of Ozone Applications. Havana, Cuba, 2000.

CARDOSO et al .Effetti biologici di una miscela di oli ozonizzati sulla ferita chirurgica sperimentale in studi preclinici. I Congresso IMOS, Italia, International Medical Ozone Society, Siena, Italia, 2 - 4 Nov. 2000.

CLARK, C. H. Use of. antibiotics in wounds. Modern veterinary pratice, (61): 308, 1980.

COTRAN, R.; LUMAR, V. and ROBBINS, S.. Robbins Patologia Estrutural e Funcional. Rio de Janeiro, Casa Edit. Guanabara Koogan, p.1216, 1991.

DUNN, W.. Enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature, (146): 837, 1940.

GOMEZ, M.; DALL'AGLIO, R.; MELEGARI, P. Domanda Brevettuale 9902602 Spagna, 25/11/1999; PCT/ES00/00208, 09/06/2000.

GURLEY, B. Ozone: Pharmaceutical sterilant of the future? Journal of Parenteral Science and Technology, 39(6), 1985.

HELD, P.:Verbrennungen: OzoNachrichten; 2:84, 1983

HOWARD, R. J.& SIMMONS, R. L .In: Surgical Infections Deseases, 3 ed (28) 533- 589, 1994.

KRIVATKIN, S. L. et al. Ozonotherapy in out-patient dermatology pratice, 12 th World Congress of. IOA. Lille, France, 1995.

MENENDEZ, A.R. ; FERNÁNDEZ, R. L. ; MENENDEZ, S.; VILLALONGA, J.. Cimetidina vs. Agua ozonificada en el tratamiento de la ulcera gastruduodenal. Estudio preliminar. Rev. Cubana Med., 27 (3): 7-13, 1988.

MONCRIEF, J. A., LINDBERG, R. G., SWITZER, W. E., PRUITT, B. A..The use of. a topical sulfonamide in the control of. burn wound sepsis. J. Trauma 6(3): 407, 1966.

MOYLAN, J. A..The proper use of. local antimicrobial agents in wounds. World J. Sur., (4) 433, 1980.

OGATA, A & NAGAHATA, H. Intramammary Application of Ozone Therapy to Acute Clinical Mastitis in Dairy Cows. J. Vet. Med. Sci., 62(7): 681-86, 2000.

PORTOLANO, F. , SAMMARTINO, A., LUONGO, C., MARMO, M.: Biochimica e fisiologia dell´ozono. Acta Toxicol. Ther., Vol.XVII , n. 2-3, 1996.

RODRIGUEZ, L.M.; CEPERO, S.M.; PERDOMO, E. O. Efectos del ozono en el tratamiento de la gingivoestomatitis herpética aguda. Revista Cubana de Estomatologia 31(1):14-17, 1994.

SANSEVERINO, R. Aspetti iminologici dell´ozonoterapia. Rivista Italiana di Omotossicologia, 3: 19-24, 1989.

SIQUEIRA Jr, F.S.; RÔÇAS, I.N., CARDOSO, C.C., MACÊDO, S.B. and LOPES, H.P.: Efeitos antibacterianos de um novo medicamento-óleo ozonizado- comparados às pastas de hidróxido de cálcio. Revista Brasileira de Odontologia, 54:4, jul./ago, 2000.

SWAIN S. F. and LEE, A. H..Topical wound medications: a review. JAVMA, 190: 1588-1593, 1987.

VALENTINE, R. An in vitro system for exposure of lung cells to gases: effects of ozone on rat macrophages, Journal of Toxicology and Environmental Health, 16:115-126, 1985.

WOLFF, A.: Eine medizinisches verwendbarkeit des ozons. Dtsch. Med. Wschr. 1915; 311

ZAMORA, J. L., Povidine-iodine and wound infection. Sugery, 121-122, january, 1984.

VEA: OZONOTERAPIA
FUNDAMENTOS E INVESTIGACIONES
EQUIPOS Y DERIVADOS